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这些菌种,禁止用于生物有机肥产品生产!

时间:2022-11-30    访问量:1069

生物有机肥产业迅猛发展的同时,也暴露出一些安全隐患。除了产品原料和辅料中存在的重金属、抗生素、有毒有害物质等潜在污染物外,生产菌种的生物安全也不容忽视。菌种作为微生物肥料产品核心参与者和功能主导者,其安全性是产品质量安全的首要保障。近年来,随着生物有机肥产业的不断发展,生产用菌种范围不断扩大,种类日益增加,目前使用的菌种涵盖了细菌、真菌、放线菌等超过70种,其不安全因素也逐渐扩大。实践中不少生产用菌种分类地位不明确,甚至混乱,难以从源头上进行安全风险的初步识别。




01


生物有机肥产品生产菌种使用现状


自农业农村部对生物有机肥产品实行登记管理以来,截至2019年6月共登记产品1872个,其中,单一菌种生物有机肥产品1006个,两种菌种复合产品716个,3种菌种复合产品121个,4种及4种以上菌种复合产品19个。产品中所使用的菌种已涵盖细菌、真菌、放线菌等72,使用菌种的范围还在不断扩大。




生物有机肥产品中主要生产菌种使用频次

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主要生产菌种使用频次见此表,可以看出,目前生物有机肥产品使用最多的是枯草芽孢杆菌,占全部登记产品的65.9%(含复合菌种产品),其次是胶质类芽孢杆菌(23.2%)、解淀粉芽孢杆菌(18.5%)、地衣芽孢杆菌(17.9%)和巨大芽孢杆菌(9.0%)。上述5种菌属于芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属,是目前国际上公认的植物根际促生菌,已广泛应用于农业生产。除了上述占主导的5种菌之外,有326个登记产品(复合)使用了其他功能菌,占比17.4%,其中,109个产品未使用上述5种功能菌,仅占比5.8%。



细菌类生产用菌种除常见的芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属菌种外,还首次出现了高地芽孢杆菌、类干酪乳杆菌、屎肠球菌、盐居固氮菌等新菌种,其中,高地芽孢杆菌和盐居固氮菌普遍存在于土壤环境中,未见致病性报道,属风险一级;类干酪乳杆菌又名为副干酪乳杆菌,虽为风险一级,但有从动物受伤部位分离到该菌的报道;屎肠球菌属于乳酸菌类,但是在一定条件下可致感染,属风险二级,建议谨慎使用。伯克霍尔德氏菌是一些具有生物防治、促进植物生长和生物修复等功能的细菌,但同时也是可以引起鼻疽、类鼻疽病的致病菌,因此真菌伯克霍尔德氏菌属于风险三级,需做致病性试验,建议慎用或不用。



真菌类生产用菌株主要为丝状真菌和酵母菌。哈茨木霉、米曲霉、淡紫紫孢菌、长枝木霉、绿色木霉、棘孢木霉、黑曲霉、粉红螺旋聚孢霉、金龟子绿僵菌等属于生物安全风险等级二级,需按照NY/T1109-2017《微生物肥料生物安全通用技术准则》进行毒理学测试。酵母菌主要以酿酒酵母为主,还有少量东方伊萨酵母、季也蒙迈耶氏酵母、杰丁塞伯林德纳氏酵母(原产朊假丝酵母、杰丁毕赤酵母)、膜醭毕赤酵母、解脂耶罗威亚酵母等,属于生物安全风险等级一级,可免做毒理学试验。但是热带假丝酵母和近平滑假丝酵母亦称为热带念珠菌和近平滑念珠菌,均为条件致病菌,医学临床研究发现,多数念珠菌可引起急性、亚急性或慢性感染等常见的真菌病。热带假丝酵母和近平滑假丝酵母属于生物安全风险等级四级,列为禁止使用的菌种。



放线菌类生产用菌株多为链霉菌属,其中细黄链霉菌和弗氏链霉菌属于生物安全风险等级一级;灰红链霉菌、娄彻链霉菌、白色链霉菌、天青链霉菌、酒红土褐链霉菌、灰螺链霉菌、不吸水链霉菌和委内瑞拉链霉菌等属于生物安全风险等级二级,需要做毒理学试验。部分企业使用的诺卡氏菌和拟诺卡氏菌也属于放线菌,但为条件致病菌,可引起人和动物的诺卡氏菌病,通过感染皮肤和内脏,引起急性、慢性或化脓性病症,风险三级,需做致病性试验,建议慎用或不用。





02


生物有机肥产品生产菌种安全性分析


虽然目前生物有机肥产品生产菌种大多采用植物根际促生菌,但近年来很多研究发现,芽孢杆菌属和类芽孢杆菌个别菌株能产生毒素。即便在菌种安全分级目录中列为第一级免做毒理学试验的菌种,如枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等个别菌株也检测到部分溶血素基因,潜在危害不容忽视。因此,开展生物有机肥产品生产菌种生物安全风险评价,从源头上把好菌种安全关是产品质量安全的首要保障。




通过调研发现,用于生物有机肥产品的部分生产菌种分类地位不明确,甚至混乱,难以从源头上进行安全风险的初步识别。以常见生产菌种枯草芽孢杆菌为例,实际上是一个表型相似的群体,包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、深褐(萎缩)芽孢杆菌、莫哈韦(莫杰夫)芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌等10个近缘种。生产企业送检的枯草芽孢杆菌生物有机肥产品,经鉴定发现很多产品实际为解淀粉芽孢杆菌,且许多菌株具有很强的溶血作用。通过对生产企业调研发现,部分生产企业选择分离于动物肠道的解淀粉芽孢杆菌作为产品生产用菌株,该类菌种生产发酵周期短、活菌数量高、生产成本低,但产品的应用功效不佳,溶血风险大,建议慎用。而植物来源的解淀粉芽孢杆菌溶血风险小,产品应用效果好,推荐使用。




生产菌株溶血反应结果统计 

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血琼脂平板培养法检测微生物溶血活性简单有效,是快速筛查病原微生物的重要手段。通过简单快速的溶血试验,可以将一些溶血的致病菌或条件致病菌在生产之初即控制住,防止其用于生产带来更大的安全风险。对代表性生物有机肥产品生产菌株进行了溶血反应测试,结果见此表,可以看出,目前生产菌种中溶血阳性反应比例最高的是苏云金芽孢杆菌,达到50%,其次是动物源解淀粉芽孢杆菌(10.99%)和侧孢短芽孢杆菌(6.25%)。



枯草芽孢杆菌的阳性比例较往年下降,其他常用菌株如地衣芽孢杆菌、胶质类芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌未见阳性菌株,而固氮菌、根瘤菌和乳酸菌亦未见溶血阳性菌株。短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和甲基营养型芽孢杆菌各有一株表现为阳性反应。



溶血反应是考察菌株生物安全性的关键项目,因此应密切关注苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌的生物安全,同时关注枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和甲基营养型芽孢杆菌。动物源性菌种生物安全风险较大,应重点关注。除此之外,进行了生产菌种急性经口毒性实验,全部生产菌株均符合低毒即实际无毒的标准要求。





03


生物有机肥原料中的微生物安全隐患


目前生物有机肥的生产原料主要来源于畜禽粪便等农业废弃物,也有部分企业违规使用工业废弃物、城市污泥及生活垃圾等,这些原料除可能含有的有毒有害物质残留外,还可能含有除有效菌外的杂菌及病毒、害虫等,严重危害人身健康。但现行标准NY884-2012《生物有机肥》对于杂菌并无限量要求,因此生物有机肥生产原料中所带来的潜在风险隐患不容忽视。



采用农业行业标准NY/T2321-2013《微生物肥料产品检验规程》和NY/T1109-2017《微生物肥料生物安全通用技术准则》方法对近千个生物有机肥样品的微生物指标、粪大肠菌群数、蛔虫卵死亡率、溶血反应、毒理学指标等进行测定,从多个样品中检测到金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、热带假丝酵母等条件致病菌。尤其是蜡样芽孢杆菌因溶血反应阳性已被禁止用作生产菌种,但却是生物有机肥类产品的常见杂菌,存在风险隐患。粪大肠菌群数、蛔虫卵死亡率检测结果符合率较高,安全风险较小。因此,需从源头上加强对生产原料中有毒有害微生物的风险评价和分析,加强对上述风险的监控,并通过行业标准制修订,明确禁用/慎用的生产原料目录清单,把好质量安全关。





04


生物有机肥产品生产禁用菌种清单


生物有机肥生产用菌种应严格执行NY/T1109-2017《微生物肥料生物安全通用技术准则》标准要求。该标准自2006年10月首次颁布实施以来,已得到广泛的采用,是微生物肥料生产菌种安全评价的根基,也是农业农村部微生物肥料产品登记管理强制执行的标准之一。但近年来,随着生物肥料行业的迅猛发展,产品中所使用的菌种范围不断扩大,种类日益增加,很多菌种分类地位发生改变,新的毒性基因和毒性物质不断检出,亟需对生产菌种安全分级目录进行补充和调整。因此,在大量文献调研基础上,汇总了委托中国疾病预防控制中心和北京市疾病预防控制中心测定的600多个菌株毒理学试验结果,重新完善了生物肥料生产菌种分级管理目录,明确了生产禁用菌种清单,形成NY1109-2017《微生物肥料生物安全通用技术准则》,目前已颁布实施。



在新修订的标准中,增加的菌种79个种,累计菌种达229个种,禁用生产菌种从原来的4个种增加到现在的25个种,包括链格孢属、黄曲霉、烟曲霉、构巢曲霉、赭曲霉、寄生曲霉、细皱曲霉、杂色曲霉、炭疽芽孢杆菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、麦角菌、欧文氏菌、镰孢菌(镰刀菌)、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌、产黄青霉、桔青霉、圆弧青霉、马尔尼菲青霉、鲜绿青霉、铜绿假单胞菌、边缘假单胞菌、丁香假单胞菌、茄科罗尔斯通氏菌(茄科假单胞菌、青枯假单胞菌)。


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